【科普】外泌体是如何制备出来的？从GMP车间到冻干瓶，都经历了哪些？

所有细胞都可以分泌外泌体。那么，如何制备出我们想要的外泌体？制备外泌体需要怎么样的环境和技术？制备出来外泌体之后，如何辨别它是不是合格？又是什么因素影响着外泌体的质量？本文我们通过简单的科普，帮助大家直观了解外泌体的制备。

在细胞的世界里，有一群微小而重要的“快递员”，它们日夜不停地穿梭于细胞之间，传递着生命的密码，它们就是外泌体。

想象一下，我们的身体里存在着一种比头发丝直径还要小上千倍的微小“包裹”，它们直径只有 30-150纳米，却装载着蛋白质、RNA等重要生物信息，在细胞间传递着关键信号。

这些神奇的生物小包裹就是外泌体，在再生医学、疾病诊断和药物递送领域掀起了一场重要变革。但要获得这些珍贵的“细胞快递员”，需要经历一场精密而复杂的制备旅程。

外泌体的生产车间需严格遵循药品生产管理规范（GMP）标准。

外泌体生产车间对人员管理、厂房设施、设备管理、物料管理、质量控制、环境监测都有着非常严格的要求。

例如，我国《GMP - 细胞治疗产品附录》（第二版）围绕生产环境、设备管理、质量追溯及人员操作等多方面提出严格要求。

① 生产环境高标准：生产设备具备良好的洁净室兼容性，不得对环境造成污染，以维持稳定、无菌的生产条件。

 ②质量追溯与数据管理强化： 需对从原材料采购到产品生产、储存及使用的全流程进行数据记录，涵盖设备参数变动、关键事件发生时间等信息。这些数据不仅是产品质量追溯的依据，还能帮助分析生产环节中可能存在的隐患，从而保障产品质量的稳定性与可追溯性。

③ 人员操作规范严格化：操作人员需严格遵循标准操作流程进行设备操作，以降低人为误差和污染风险，保障生产过程的稳定性和可靠性。

外泌体的细胞来源通常是脐带、胎盘或脂肪来源的间充质干细胞，其中脐带来源的干细胞被证实是外泌体产量最高的。

外泌体源自于于细胞的培养过程，例如当间充质干细胞在培养瓶中地生长，当融合度适宜时，便进入生产外泌体的关键阶段[1-3]。

当干细胞在培养箱中分泌出足够的外泌体后，真正的提取工艺就开始了。这个过程就像沙里淘金，需要经过多道精密工序。

图片来自文献2

第一步：初步分离

细胞培养液首先经过低速离心，去除完整的细胞；再通过较高速度离心，去除死细胞碎片；最后离心去除大囊泡和凋亡小体。

经过这三步，我们得到的上清液中就含有我们需要的外泌体。

第二步：浓缩与纯化

传统方法采用超速离心，通过 2小时以上的高速旋转，让外泌体沉淀到离心管底部。但这种方法效率低，且强大的离心力可能破坏外泌体的完整性。现代工艺也开发了分子筛层析、阴离子交换法、PEG-蔗糖保护法等等新方法。

第三步：浓缩与保存

纯化后的外泌体溶液可能还很稀，需要进行离浓缩纯化。最后得到外泌体制剂，短期存放在 4℃，长期则需保存在 -80℃ 的环境中[1-3]。

图片来自文献[3]

为了提高干细胞外泌体的产量，3D培养技术、切向流过滤（TFF）系统、中空纤维生物反应器、自动化连续生产系统等新技术的发展[1-3]，使得工业化外泌体生产工艺有了新突破。

不是所有提取出来的外泌体都合格。我们需要通过多重检测确保它们的“品质”。

图片来自文献[1]

形态检测：在 透射电镜下，优质外泌体呈典型的 “茶托状”或杯状 结构。

粒径分析：使用纳米颗粒跟踪分析技术（NTA），检测外泌体的粒径分布和浓度。如人脐带间充质干细胞外泌体的典型粒径为 146.7±4.9nm。

标志蛋白检测：通过 Western blot 检测外泌体标志蛋白CD9、CD63、CD81等的表达，这些都是外泌体的“身份证”。

纯度与杂质控制：需清除生产残留物（如血清蛋白残留量<50 ng/mL、核酸酶残留等） ，同时检测阴性标志物（如Calnexin）确保无细胞杂质污染；需符合无菌检查和内毒素检测；通过Western Blot验证Alix/TSG101表达，排除凋亡小体或微囊泡污染等。

产量与活性：最后还要检测总蛋白浓度和功能活性[1-3]。

在外泌体的获取过程中，多个因素直接影响外泌体的最终质量。制备工艺作为保障外泌体质量的关键要素，贯穿于外泌体从获取到应用的整个流程。

在细胞培养阶段，适宜的培养基成分、精准的温度与气体环境控制，能确保细胞健康生长，为外泌体的分泌提供良好基础，直接影响外泌体的产量与初始质量。

例如，通常需要使用合适的细胞单次。代次过低产量不足，代次过高则外泌体的活性可能下降。

收集外泌体也需要有自己的最佳培养时间。时间太短产量低，时间太长可能导致细胞状态下降。

还需要选择最佳的细胞融合度以及氧气环境，同时提取工艺对外泌体的质量也会产生很大的影响。

在分离纯化环节环节，采用超速离心、密度梯度离心或免疫亲和捕获等不同方法，需依据外泌体特性及后续用途精心选择，以最大程度去除杂质，获得高纯度外泌体。

此外，制备过程中的无菌操作、严格的条件监控以及规范的质量检测，都不可或缺。

任何一个环节的疏忽，都可能导致外泌体活性降低、结构破坏或杂质残留，进而影响其临床应用效果。所以，优化制备工艺，是提升外泌体质量、推动其广泛应用的核心所在。